🧬 smallRNaseq Pipeline

Este repositorio contiene un conjunto de scripts para el análisis de datos de small RNA-seq, con especial énfasis en el preprocesamiento de datos brutos, alineamiento, cuantificación, análisis diferencial y exploraciones posteriores como PCA, deconvolución, enriquecimiento funcional y análisis de supervivencia.

El pipeline está diseñado para ejecutarse parcialmente en clústeres HPC (High Performance Computing), especialmente los pasos escritos en Bash, y se complementa con análisis downstream en R y Python.

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📁 Estructura del repositorio

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├── envs/                        # Entornos conda necesarios
│   └── *.yml
├── references/
│   ├── EMN_45S_rRNA.gtf
│   ├── EMN_45S_rRNA.fa / .fai
│   ├── sRNA-adapters.fa
│   └── Ruiz-Moreno_et-al_2022.xlsx
├── reports/                     
│   ├── multiqc_report_*.html
│   ├── multiqc_general_stats.txt
│   ├── fastqc_length_distribution.txt
│   └── trimmingTools/*.tsv
├── src/
│   ├── HPC_analysis/            # Scripts principales a ejecutar en HPC
│   │   ├── 1-QC/                # Control de calidad inicial (FastQC)
│   │   │   └── 1_QC_fastqc.sh
│   │   ├── 2-trimming/          # Recorte de adaptadores 
│   │   │   ├── 2-Trimming_trim_galore.sh
│   │   │   ├── 2-Trimming_trimmomatic.sh
│   │   │   └── 2-Trimming_fastp.sh
│   │   ├── 3-alignment/         # Alineamiento con STAR
│   │   │   ├── A-generate_STAR_indexes.sh
│   │   │   ├── B-alignment_STAR_rRNA.sh
│   │   │   └── B-alignment_STAR_GRCh38.sh
│   │   ├── 4-quantification/    # Cuantificación con Salmon
│   │   │   ├── A-salmon_index.sh
│   │   │   ├── B-salmon.sh
│   │   │   ├── C-salmon_unmapped.sh
│   │   │   ├── D-create_TPM_table.sh
│   │   │   ├── E-mapping_rates.sh
│   │   │   └── GetSalmonTPMs_mch.R
│   │   └── 5-reads_distribution/
│   │       └── process_depth.sh
│   └── Downstream_analysis/     # (R/Python, notebooks, visualización)
│       ├── DGE/
│       │   ├── Salmon_DEG_analysis.Rmd
│       │   └── Gene_biotype_DEG_gencode.Rmd
│       ├── GO/
│       │   └── GO_clusterprofiler.Rmd
│       ├── Figure_3/adapter_plot.ipynb
│       ├── Figure_4/General_stats.ipynb
│       ├── Figure_5/
│       │   ├── Gene_biotype_refseq.Rmd
│       │   ├── Gene_biotype_gencode.Rmd
│       │   └── plot_mappingRate_diff.ipynb
│       ├── Figure_7/plot_depth.ipynb
│       ├── Figure_12/miRNA_interaction_network.Rmd 
│       ├── Figure_16/Deconvolution.Rmd
│       └── Figure_17/
│           ├── Forest_plot.Rmd
│           └── survival_data.Rmd

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🔁 Flujo de trabajo

1. Control de calidad inicial

   • Script: src/HPC_analysis/1-QC/1_QC_fastqc.sh
   • Outputs: reports/fastqc_length_distribution.txt reports/multiqc_general_stats.txt
   • Visualización: src/Downstream_analysis/Figure_4/General_stats.ipynb

2. Recorte de adaptadores

   • Scripts:
     • src/HPC_analysis/2-trimming/2-Trimming_trim_galore.sh
     • src/HPC_analysis/2-trimming/2-Trimming_trimmomatic.sh
     • src/HPC_analysis/2-trimming/2-Trimming_fastp.sh
   • Adaptadores: references/sRNA-adapters.fa
   • Output: reports/trimmingTools/*.tsv
   • Visualización: src/Downstream_analysis/Figure_3/adapter_plot.ipynb

3. Alineamiento con STAR

   • Index script: src/HPC_analysis/3-alignment/A-generate_STAR_indexes.sh
   • Alineamiento contra rRNA: src/HPC_analysis/3-alignment/B-alignment_STAR_rRNA.sh
   • Alineamiento contra genoma humano (GRCh38): src/HPC_analysis/3-alignment/B-alignment_STAR_GRCh38.sh

4. Cuantificación con Salmon

   • Index script: src/HPC_analysis/4-quantification/A-salmon_index.sh
   • Cuantificación: src/HPC_analysis/4-quantification/B-salmon.sh
   • Cuantificación reads no mapeados: src/HPC_analysis/4-quantification/C-salmon_unmapped.sh
   • Generación de tablas TPM: src/HPC_analysis/4-quantification/D-create_TPM_table.sh + GetSalmonTPMs_mch.R
   • Porcentajes de mapeo: src/HPC_analysis/4-quantification/E-mapping_rates.sh
   • Visualización: src/Downstream_analysis/Figure_5/plot_mappingRate_diff.ipynb

5. Distribución de lecturas

   • Script: src/HPC_analysis/5-reads_distribution/process_depth.sh
   • Visualización: src/Downstream_analysis/Figure_7/plot_depth.ipynb

6. Análisis expresión diferencial

   • Script: Downstream_analysis/DGE/Salmon_DEG_analysis.Rmd, Gene_biotype_DEG_gencode.Rmd
   • Enriquecimiento funcional (GO): Downstream_analysis/GO/GO_clusterprofiler.Rmd
   • Red de interacción miRNA-target: Downstream_analysis/Figure_12/miRNA_interaction_network.Rmd. Se apoya en la base de datos miRDB.
   • Estudio de deconvolución: Downstream_analysis/Figure_16/Deconvolution.Rmd. Necesita del archivo de anotaciones reports/Ruiz-Moreno_et-al_2022.xlsx
   • Análisis de supervivencia: Downstream_analysis/Figure_17/survival_data.Rmd + Forest_plot.Rmd

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📊 Informes

Los informes de calidad se encuentran en la carpeta reports/ e incluyen salidas de MultiQC y métricas derivadas de diferentes herramientas de trimming y alineamiento:

• multiqc_report_fastp.html
• multiqc_report_trim_galore.html
• multiqc_report_trimmomatic.html
• multiqc_report_fastp_merged.html
• multiqc_general_stats.txt
• fastqc_length_distribution.txt

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⚙️ Dependencias

Este pipeline utiliza scripts en Bash, R y Python. Algunas herramientas clave utilizadas incluyen:

• FastQC, Trim Galore, Trimmomatic, Fastp
• STAR, Salmon, MultiQC
• R con paquetes para análisis de expresión, enriquecimiento y supervivencia (DESeq2, ggplot2, clusterProfiler, etc.)

Las dependencias están organizadas en archivos de entorno (.yml) dentro de la carpeta ./envs/. Para lanzar los scripts del clúster HPC se necesitará la instalación y activación del correspondiebte. Esto garantiza la reproducibilidad en clústeres HPC.

📂 Entornos disponibles

• ./envs/QControl.yml → Control de calidad (FastQC, MultiQC, etc.)
• ./envs/STAR.yml → Alineamiento con STAR
• ./envs/salmon.yml → Cuantificación con Salmon
• ./envs/DGE_analysis.yml → Análisis de expresión diferencial (R con DESeq2, ggplot2, etc.)
• ./envs/biotools.yml → Herramientas generales de bioinformática. Incluye herramientas de trimming, samtools, etc.

▶️ Creación de entornos

Para crear un entorno:

conda env create -f ./envs/NOMBRE.yml
conda activate NOMBRE

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🧑‍💻 Autora

Maria Carazo Hidalgo
Bioinformática
Correo: mariacarazohidalgo@gmail.com